Dithiothreitol (DTT), yeni yaşıl əlavə olaraq da tanınan, tez-tez istifadə edilən azaldıcı agentdir.İki merkaptan qrupu (-SH) olan kiçik molekulyar üzvi birləşmədir.Azaldıcı xüsusiyyətlərinə və sabitliyinə görə DTT biokimya və molekulyar biologiya təcrübələrində geniş istifadə olunur.
DTT-nin əsas rolu zülallarda və digər biomolekullarda disulfid bağlarını azaltmaqdır.Disulfid bağı zülal qatlanmasının və sabitliyinin mühüm hissəsidir, lakin müəyyən eksperimental şəraitdə, məsələn, azaldıla bilən SDS-PAGE analizi, zülalın rekombinasiyası və qatlanması kimi, disulfid bağını iki tiol qrupuna endirmək lazımdır. protein.DTT, onları merkaptan qruplarına endirmək üçün disulfid bağları ilə reaksiya verə bilər, beləliklə, zülalın məkan quruluşunu açır və təhlil və manipulyasiyanı asanlaşdırır.
DTT həmçinin ferment aktivliyini və sabitliyini qorumaq üçün istifadə edilə bilər.Bəzi ferment katalizli reaksiyalarda fermentin aktivliyi oksidləşdirici tərəfindən azalda bilər.DTT oksidləşdiricilərlə reaksiyaya girərək onları zərərsiz maddələrə çevirə bilir və bununla da fermentin fəaliyyətini və sabitliyini qoruyur.
β-merkaptoetanol (β-ME) kimi ənənəvi azaldıcı maddələrlə müqayisədə DTT daha təhlükəsiz və daha sabit azaldıcı agent hesab olunur.O, yalnız sulu məhlulda sabit deyil, həm də yüksək temperatur və turşu-əsas şəraitində reduksiya xassələrini saxlayır.
DTT-nin istifadəsi nisbətən sadədir.Ümumiyyətlə, DTT müvafiq buferdə həll edilir və sonra eksperimental sistemə əlavə edilir.DTT-nin optimal konsentrasiyası xüsusi təcrübəyə uyğun olaraq müəyyən edilməlidir və ümumiyyətlə 0,1-1mM diapazonunda istifadə olunur.Aşağı konsentrasiyalar hüceyrə böyüməsinə mənfi təsirləri azalda bilər və hədəf zülalların həddindən artıq ifadəsi səbəbindən sitotoksikliyi azalda bilər.Daha yüksək konsentrasiyalar hüceyrə artımına və ifadə səmərəliliyinə təsir edərək həddindən artıq hüceyrə metabolik yükə səbəb ola bilər.
Optimal konsentrasiyanı təyin etməyin yolu müxtəlif konsentrasiyalarda IPTG induksiya testlərini aparmaqla hədəf zülalın ifadə səviyyəsini qiymətləndirmək ola bilər.Kiçik miqyaslı mədəniyyət testləri bir sıra IPTG konsentrasiyalarından (məsələn, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM və s.) istifadə etməklə həyata keçirilə bilər və müxtəlif konsentrasiyalarda ifadə effekti hədəf zülalın ifadə səviyyəsinin aşkarlanması ilə qiymətləndirilə bilər (məsələn, Qərbi ləkə və ya flüoresan aşkarlanması).Eksperimental nəticələrə əsasən, ən yaxşı ifadə effekti verən konsentrasiya optimal konsentrasiya kimi seçilmişdir.
Bundan əlavə, oxşar eksperimental şəraitdə ümumi istifadə edilən IPTG konsentrasiyası diapazonunu başa düşmək üçün müvafiq ədəbiyyata və ya digər laboratoriyaların təcrübəsinə müraciət edə və sonra eksperimental ehtiyaclara uyğun olaraq optimallaşdıra və tənzimləyə bilərsiniz.
Qeyd etmək vacibdir ki, optimal konsentrasiya müxtəlif ifadə sistemlərindən, hədəf zülallardan və eksperimental şəraitdən asılı olaraq dəyişə bilər, ona görə də hər bir halda optimallaşdırmaq daha yaxşıdır.
Xülasə, DTT zülallarda və digər biomolekullarda disulfid bağlarını azaltmaq və ferment aktivliyini və sabitliyini qorumaq üçün istifadə edilə bilən çox istifadə edilən azaldıcı agentdir.O, biokimya və molekulyar biologiya təcrübələrində geniş istifadə edilmişdir.
Göndərmə vaxtı: 28 sentyabr 2023-cü il