IPTG (izopropil-β-D-tioqalaktozid) yüksək induksiya qabiliyyətinə malik β-qalaktozidaza substratının analoqudur. IPTG-nin induksiyası altında induktor repressor zülalı ilə kompleks əmələ gətirə bilər, beləliklə, repressor zülalının konformasiyası dəyişir və hədəf genlə birləşə bilmir və hədəf gen səmərəli şəkildə ifadə olunur. Bəs təcrübə zamanı IPTG-nin konsentrasiyası necə təyin olunmalıdır? Nə qədər böyükdürsə, bir o qədər yaxşıdır?
Əvvəlcə IPTG induksiyası prinsipini başa düşək: E. coli-nin laktoza operonu (elementi) müvafiq olaraq β-qalaktozidaza, permeaza və asetiltransferazanı kodlayan üç struktur geni, Z,Y və A ehtiva edir. lacZ laktozanı qlükoza və qalaktozaya və ya allo-laktozaya hidroliz edir; lacY ətraf mühitdəki laktozanın hüceyrə membranından keçməsinə və hüceyrəyə daxil olmasına imkan verir; lacA asetil qrupunu asetil-CoA-dan β-qalaktozidə ötürür ki, bu da Toksik effektin aradan qaldırılmasını əhatə edir. Bundan əlavə, əməliyyat ardıcıllığı O, başlanğıc ardıcıllığı P və tənzimləyici geni I mövcuddur. I gen kodu operator ardıcıllığının O mövqeyinə bağlana bilən repressor zülaldır ki, operon (meta) repressiya olunur və söndürülür. Başlanğıc ardıcıllığı P-dən yuxarıda katabolik gen aktivatoru zülal-CAP bağlanma yeri üçün də bir bağlanma yeri mövcuddur. P ardıcıllığı, O ardıcıllığı və CAP bağlanma yeri birlikdə lak operonunun tənzimləyici bölgəsini təşkil edir. Gen məhsullarının əlaqələndirilmiş ifadəsinə nail olmaq üçün üç fermentin kodlaşdırıcı genləri eyni tənzimləyici bölgə tərəfindən tənzimlənir.
Laktoza olmadıqda, lak operon (meta) repressiya vəziyyətindədir. Bu zaman PI promotor ardıcıllığının nəzarəti altında I ardıcıllığı ilə ifadə olunan lak repressoru O ardıcıllığına bağlanır ki, bu da RNT polimerazasının P ardıcıllığına bağlanmasının qarşısını alır və transkripsiyanın başlanmasını maneə törədir; laktoza mövcud olduqda, lak operon (meta) induksiya edilə bilər. Bu operon (meta) sistemində əsl induktor laktozanın özü deyil. Laktoza hüceyrəyə daxil olur və β-qalaktozidaza tərəfindən katalizləşdirilərək allolaktoza çevrilir. Sonuncu, induktor molekulu olaraq, repressor zülalına bağlanır və zülal konformasiyasını dəyişdirir ki, bu da repressor zülalının O ardıcıllığından və transkripsiyadan ayrılmasına səbəb olur. İzopropiltioqalaktozid (IPTG) allolaktoza ilə eyni təsirə malikdir. Bakteriyalar tərəfindən metabolizə olunmayan və çox sabit olan çox güclü bir induktordur, buna görə də laboratoriyalarda geniş istifadə olunur.
IPTG-nin optimal konsentrasiyasını necə təyin etmək olar? Nümunə olaraq E. coli-ni götürək.
Müsbət rekombinant pGEX (CGRP/msCT) ehtiva edən E. coli BL21 genetik modifikasiya olunmuş ştammı 50μg·mL-1 Amper ehtiva edən LB maye mühitinə inokulyasiya edilmiş və 37°C-də bir gecə ərzində becərilmişdir. Yuxarıdakı kultura genişləndirmə kulturası üçün 1:100 nisbətində 50μg·mL-1 Amper ehtiva edən 10 şüşə 50 ml təzə LB maye mühitinə inokulyasiya edilmiş və OD600 dəyəri 0.6~0.8 olduqda, son konsentrasiyaya IPTG əlavə edilmişdir. Bu, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1-dir. Eyni temperaturda və eyni vaxtda induksiyadan sonra ondan 1 ml bakteriya məhlulu götürüldü və bakteriya hüceyrələri santrifüqləmə yolu ilə toplandı və müxtəlif IPTG konsentrasiyalarının zülal ifadəsinə təsirini təhlil etmək və sonra ən böyük zülal ifadəsinə malik IPTG konsentrasiyasını seçmək üçün SDS-PAGE-yə məruz qaldı.
Təcrübələrdən sonra IPTG konsentrasiyasının mümkün qədər yüksək olmadığı aşkar ediləcək. Bunun səbəbi IPTG-nin bakteriyalar üçün müəyyən bir toksikliyə malik olmasıdır. Konsentrasiyanı aşmaq hüceyrəni də öldürəcək; və ümumiyyətlə, ümid edirik ki, hüceyrədə nə qədər çox həll olan zülal ifadə olunarsa, bir o qədər yaxşıdır, lakin bir çox hallarda IPTG konsentrasiyası çox yüksək olduqda çox miqdarda inklüziya əmələ gələcək. Bədən, lakin həll olan zülalın miqdarı azalır. Buna görə də, ən uyğun IPTG konsentrasiyası çox vaxt nə qədər böyük olarsa, bir o qədər yaxşıdır, əksinə konsentrasiya nə qədər aşağı olarsa, o qədər yaxşıdır.
Genetik modifikasiya olunmuş ştammların induksiyası və becərilməsinin məqsədi hədəf zülalın məhsuldarlığını artırmaq və xərcləri azaltmaqdır. Hədəf genin ifadəsinə yalnız ştammın öz amilləri və plazmid ifadəsi deyil, həm də induktorun konsentrasiyası, induksiya temperaturu və induksiya müddəti kimi digər xarici şərtlər də təsir göstərir. Buna görə də, ümumiyyətlə, naməlum bir zülal ifadə olunmadan və təmizlənmədən əvvəl, uyğun şərtləri seçmək və ən yaxşı təcrübi nəticələr əldə etmək üçün induksiya vaxtını, temperaturu və IPTG konsentrasiyasını öyrənmək ən yaxşısıdır.
Yayımlanma vaxtı: 31 Dekabr 2021